受害人陳述

我是一名快要開題的研二學(xué)生，入學(xué)來跟著師兄師姐也做了無數(shù)次的 PCR 實(shí)驗(yàn)了，怎么也算是經(jīng)驗(yàn)頗豐了。

為了在開題報(bào)告里多放一些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，最近從一大清早忙到半夜，一直跑 PCR，居然無一例外全都撲街了！

是試劑？引物？模板？還是有人要害我？亦或是傳說中的 PCR 殺手作祟？

這太可怕了，你愿意跟我一層一層來揭秘嗎？

第 一次實(shí)驗(yàn)

消失的樣品

像往常一樣，我配置了一個(gè) 50uL 的 PCR 體系，設(shè)置的 PCR 程序?yàn)?2h，等跑完我拿出來一看，樣品居然只剩下一半左右！這是合理的嗎？

（圖片來源丁香實(shí)驗(yàn)）

可能情況

A：PCR 儀的熱蓋溫度過低，液體都在蓋上

B：小手一抖 PCR 管蓋子沒蓋緊，蒸發(fā)了

C：實(shí)驗(yàn)室采購的 PCR 管質(zhì)量太差，按緊了仍然蒸發(fā)

D：PCR 管熱化了，蓋子形變蒸發(fā)了

E：PCR 管內(nèi)的液體變成蝴蝶飛走啦

F：有人針對(duì)我

答案解析

A.正確。當(dāng)熱蓋溫度設(shè)置的過低，PCR 程序溫度高于它的時(shí)候，會(huì)導(dǎo)致液體蒸發(fā)到蓋上；B、C、D. 正確。PCR 管蓋子沒蓋緊、質(zhì)量過差難以蓋緊或者加熱導(dǎo)致的 PCR 管形變蓋子翹起來也會(huì)導(dǎo)致液體蒸發(fā)掉。E.錯(cuò)誤。這一看就不對(duì)，除了香妃其他東西都是變不成蝴蝶噠，實(shí)驗(yàn)出 bug 的時(shí)候不要開始幻想，請(qǐng)老老實(shí)實(shí)學(xué)習(xí)。F：大概率是你想多了。

解決辦法

注意啦，跑 PCR 程序前一定要先確認(rèn)熱蓋的溫度高于 PCR 程序里各步驟的溫度；購買 PCR 管的時(shí)候，一定要選擇潔凈度和密封性高的；閱讀 PCR 儀說明書看機(jī)器適配的耗材范圍。

第二次實(shí)驗(yàn)

多出來的鬼影條帶

因?yàn)楹ε挛廴荆詫?shí)驗(yàn)中使用的試劑、水、引物都是新的。理論上講，所有的東西應(yīng)該很干凈，最 后卻在凝膠電泳時(shí)，發(fā)現(xiàn)所有樣品（包括陰性對(duì)照）里都出現(xiàn)了非特異條帶！氣得我瘋狂掐人中，這個(gè)條帶究竟從哪冒出來的啊？

（圖片來源丁香實(shí)驗(yàn)）

可能情況

A：引物設(shè)計(jì)的太菜

B：退火溫度太低

C：PCR 循環(huán)次數(shù)過多

D：新的 PCR 管質(zhì)量太差本身就不干凈（為了省錢）

E：儲(chǔ)存水的離心管重復(fù)利用（還是為了省錢）被污染了

F：討厭你的人偷偷打開 PCR 儀器給你加了點(diǎn)料

答案解析

 A. 正確。小白們剛開始做 PCR 很容易因?yàn)橐镌O(shè)計(jì)的太爛，導(dǎo)致 PCR 跑出來有非特異條帶；B. 正確。引物有自己的最 佳退火溫度范圍，如果低于這個(gè)溫度可能會(huì)有非特異條帶；C. 正確，PCR 循環(huán)次數(shù)過多也是會(huì)出現(xiàn)的；D、E. 正確。使用的 PCR 管潔凈度不夠或者使用二次利用的離心管儲(chǔ)存水，可能會(huì)導(dǎo)致外源 DNA 污染。F. 錯(cuò)誤。你怎么還會(huì)選這個(gè)？你這個(gè)年齡段你怎么還會(huì)選這個(gè)？

解決辦法

優(yōu)化你的引物設(shè)計(jì)和退火溫度設(shè)置，掉過坑踩過雷的師兄師姐們就是實(shí)驗(yàn)室給你的饋贈(zèng)，去請(qǐng)教，去學(xué)習(xí)引物設(shè)計(jì)軟件網(wǎng)站，退火溫度也可以通過梯度預(yù)實(shí)驗(yàn)來優(yōu)化；一般 PCR 循環(huán)次數(shù) 25-30 次即可；使用潔凈度更高的 PCR 管，儲(chǔ)存母本液體時(shí)使用新的離心管，經(jīng)費(fèi)用在刀刃上，才能更省錢。如果你堅(jiān)持認(rèn)為 F 選項(xiàng)也不是沒有可能，那實(shí)驗(yàn)之外要花點(diǎn)時(shí)間在你的人際關(guān)系管理上了。

第三次實(shí)驗(yàn)

變成彗星的樣品

我這次學(xué)聰明了，用了新的 PCR 管，終于沒有污染的條帶了。但我要的條帶也沒了！凝膠電泳后我的產(chǎn)物拖尾無明顯條帶，我的樣品離家出走了嗎？

（圖片來源丁香實(shí)驗(yàn)）

可能情況

A：你這模板降解了吶

B：你這模板量明顯不夠吶

C：Taq 酶具有 5’-3’ 外切酶活性，循環(huán)次數(shù)過多就對(duì)產(chǎn)物下手了

D：用的 PCR 管、儲(chǔ)存水的離心管核酸酶污染

E：DNA 不想上班裂開了

答案解析

A. 正確。劃重 點(diǎn)，一定要保證模板的新鮮度，每年都有那么些個(gè)怨種同學(xué)用已經(jīng)降解的樣本做模板，這種情況 PCR 失敗的不冤；B. 正確。普通 PCR 15-20ng 的模板量已經(jīng)足夠，只要這么點(diǎn)就不要克扣給足量了啦；C. 正確。如果使用了 Tap 酶，循環(huán)數(shù)過多，它的 5’-3’ 外切酶活性會(huì)把你的產(chǎn)物切切切；D. 正確。所使用的的 PCR 管或者裝母液的離心管有外源性核酸酶污染也會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物降解；E 錯(cuò)誤。DNA：是誰不想上班裂開了我不說。

解決辦法

PCR 實(shí)驗(yàn)條件允許的話，可以先凝膠電泳鑒定一下模板，使用新鮮且足量的模板才能獲得好的 PCR 結(jié)果；不要設(shè)置過多的循環(huán)數(shù)；選擇質(zhì)量更好的無核酸酶的 PCR 管以及使用全新的離心管儲(chǔ)存母液。

第四次實(shí)驗(yàn)

斷聯(lián)的樣品

配置了一大管 PCR 樣品，分裝成 5 管同時(shí)跑程序，結(jié)果核酸膠鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)五胞胎們有條帶亮度不一致的，有條帶干脆沒有的。我可以報(bào)警嗎？

（圖片來源丁香實(shí)驗(yàn)）

可能情況

A：分裝前樣品沒有搖一搖

B：PCR 管開小差，傳熱又不積極又不均勻

C：凝膠電泳時(shí)上樣量不一致

D：有些管的樣品跑程序的時(shí)候摸魚

答案解析

A. 正確。樣品如果分裝，未混勻肯定會(huì)導(dǎo)致結(jié)果不一致；B. 正確。PCR 管傳熱低效、傳熱不均勻也會(huì)導(dǎo)致各管結(jié)果不一致；C. 正確。核酸膠上樣時(shí)上樣量沒有控制一致，跑出來亮度當(dāng)然不一樣啦。D. 錯(cuò)誤。但你實(shí)在認(rèn)為對(duì)的話，怕樣品摸魚可以哄哄它，答應(yīng)它發(fā)了文章的話就放它照片。

解決辦法

敲黑板！分裝前一定要混勻；選擇認(rèn)真負(fù)責(zé)的 PCR 管，傳熱又高效又均勻的那種；上樣要做到精 準(zhǔn)上樣，要控制上樣量一致，不要 loading 隨便點(diǎn)一點(diǎn)、sample 3uL 5uL 隨便整，拿出科研人的嚴(yán)謹(jǐn)來！

我們事無巨細(xì)地分析了一個(gè)個(gè)造成實(shí)驗(yàn)失敗的可能原因，排除了一個(gè)個(gè)因素。最 后發(fā)現(xiàn)了一個(gè)共性問題，即使可能性再小但真相或許就在這里：殺手可能就是隱藏在實(shí)驗(yàn)背后的 PCR 管！質(zhì)量不過關(guān)的 PCR 管蓋子如果蓋不緊，會(huì)在加熱時(shí)發(fā)生形變，導(dǎo)致外源異物或者核酸酶的污染，傳熱也會(huì)低效且不均勻。這罪狀一樁樁列出來，羅翔老師看了都不敢做辯護(hù)！

PCR 雖然是科研人常做的實(shí)驗(yàn)，但卻也常常出錯(cuò)。由于體系內(nèi)成分復(fù)雜，出現(xiàn)不理想的結(jié)果時(shí)排查起來非常麻煩，大多數(shù)只知道要考慮到引物、模板、外源污染和不正當(dāng)操作的問題，殊不知不合格的 PCR 管也會(huì)給實(shí)驗(yàn)帶來干擾。

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? 96 孔板孔邊緣加高的特別設(shè)計(jì)，可適用于密封墊、薄膜、鋁膜、熱封膜等多種密封方式

02

? 薄壁設(shè)計(jì)，確保高效均勻傳熱

03

? 采用優(yōu)質(zhì)材料，不含 DNA 酶、RNA 酶及無熱原

04

? 采用優(yōu)質(zhì)材料，單管、八連排管經(jīng)滅菌處理，無污染 

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01精 準(zhǔn)適配 Eppendorf 移液器，并通用適配市場(chǎng)主流移液器

02無 DNA 酶、無 RNA 酶、無熱原、無人源 DNA

03吸頭表面光滑，可減少樣品殘留，確保實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性

文 末 互 動(dòng)

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