使用原子力顯微鏡可以很容易的研究細胞表面的形貌以及力學性質，在2019年發表于Nanoscale的文章中Nanoscale, 2019,11, 10320-10328, https://doi.org/10.1039/C8NR08955H）里爾巴斯德研究所的Frank Lafont等將布魯克NanoWizard Ultra Speed生物型原子力顯微鏡與STED超分辨熒光顯微鏡相結合，在納米尺度上對細胞內的細胞器和微生物進行了表征。作者分別對感染了假結核病桿菌（Yersinia pseudotuberculosis）的固定PtK2細胞和活細胞中的線粒體進行了測試。

作者使用彈性系數大約0.09N/m、曲率半徑大約8nm的AC40探針測試細胞樣品的模量和硬度，利用BioAFM的SPM軟件進行Sader法校準（Contact-free）探針。在使用QI模式進行掃描時，作用力被設定為不損壞細胞的情況下的*值。對于固定細胞作用力大約3 nN，活細胞大約1 nN。通過明場顯微鏡觀察細胞的形態和QI模式中力曲線是否發生破裂（rupture event）即可判斷細胞是否受損。得益于NanoWizard UltraSpeed原子力顯微鏡的高速性能，探針在Z方向的速度（Z speed）達到了300 μm/s，Z方向距離（Z range）為2 μm，力曲線的噪聲控制在19-24 pN。

圖1  (a) 使用Sneddon模型擬合壓入曲線（黑色），計算自接觸點（POC）處的表觀楊氏模量（綠色）；(b) 由于檢測到的細胞內部模量不同而導致的力-距離曲線的扭曲，形成不同剛度的片段（從藍色：軟 到 紅色：硬）。

細胞的彈性模量使用Sneddon模型擬合下壓力曲線（Approach FD curve）得到。樣品的型變量δ與接觸力F、樣品的楊氏模量E、泊松比ν和探針*的半角α都有關系。雖然AC40的針尖形狀既不是純球形也不是圓錐形，但在較大壓入深度下，可以看作是圓錐形。（圖1 a）

然而，當在細胞上使用相對小的壓頭進行大壓入深度實驗時，FD力曲線顯示出非線性和不均勻性（圖1b），這對應于細胞內部結構剛度的差異。這時使用傳統的Hertz/Sneddon模型不能恰當地描述數據。如果分段擬合下壓曲線的斜率，就可以獲得每一段的剛度數值：

ΔSi = ΔFi/Δδi,

其中Si是剛度，Fi是力，δi是段i的壓入深度。作者使用自自行開發的軟件（pyAF，Python原子力）進行的數據處理就可以得到剛度斷層數據。

(a) 細胞表面形貌圖（作用力為零，平面擬合）。(b) 細胞表面受作用力后的形貌圖（3 nN，平面擬合）。(c) 在每個點擬合FD力曲線計算的表觀彈性模量圖。(d) 不同壓入深度下的剛度斷層圖：左側：[0–50] nm，右側：[200–250] nm。(e) 對應于不同細胞內區域的表觀彈性模量。(f) 結合STED超分辨率顯微鏡識別細胞區域。左：DAPI，中：LC3，右：肌動蛋白。(g) 結合透射電子顯微鏡獲得的超微結構（2張切片）。白色箭頭：肌動蛋白；紅色虛線：細菌；白色環：線粒體。比例尺：白色：2 μm，黑色：500 nm。

為了測試細胞內微生物的模量，作者對感染了假結核病桿菌（Yersinia pseudotuberculosis）的固定PtK2細胞進行了原子力顯微鏡（AFM）實驗。細胞被感染后固定，并標記了肌動蛋白細胞骨架、細菌和LC3陽性的自噬泡。通過明場顯微鏡、熒光顯微鏡、AFM以及電子顯微鏡依次對單個細胞進行成像（圖2a、f和g）。圖2a顯示了細胞在探針作用力為零時的圖像。此時細胞內部區域不可見，但我們可以觀察到固定對膜孔的影響。圖2b顯示了在*壓入深度時細胞的高度圖。樣品內的不同硬度導致了相同施加力的不同*壓入深度。一些結構（可能對應于細菌、線粒體和肌動蛋白細胞骨架）變得清晰可見。經熒光和電子顯微鏡可以確認細菌（紅色虛線）的位置（圖2f和g）。細菌用DAPI和LC3標記，表明細菌位于自噬泡中（圖2f左和中）。AFM和熒光觀察還可以獲得有關肌動蛋白細胞骨架的相關性。*，線粒體通過電子顯微鏡觀察到（圖2g）。通過表觀彈性模量圖（圖2c）可以看出來肌動蛋白池和細菌的似乎比線粒體更硬。通過對不同感興趣區域的彈性模量進行量化可以證實這一點（圖2e）。對同一數據上在兩個壓入深度[0–50] nm和[200–250] nm上執行了剛度斷層掃描（圖2d）后，可以發現在低壓入深度時，可以識別出3個肌動蛋白束。在更大的壓入深度時，這些束消失了。這表明它們位于細胞頂部，而AFM在細胞更深處探測到了幾個線粒體。

(a) 顯示了活體PtK2細胞內線粒體的大尺度熒光圖像，白色方框突出顯示了AFM掃描區域；(b) 以1 nN作用力進行掃描的線粒體的時間序列熒光圖像；(c) 以3 nN觸發力進行掃描的線粒體的時間序列熒光圖像。比例尺：1 μm，白色方框：AFM掃描區域；白色圓盤：AFM探針位置；黑色環：原始線粒體形狀；黑色箭頭：融合位點；白色箭頭：分裂位點。

作者隨后在37°C的HEPES緩沖介質中對活細胞進行了壓入實驗。如圖3b所示，普通大小的作用力并不會產生線粒體的形態學變化。然后，作者通過施加更高的觸發力（圖3c）能夠移動、融合甚至分裂一些線粒體。選擇適當的力用于活細胞剛度測量非常重要。實際的作用力將取決于細胞類型以及針尖的幾何形狀，因為更尖銳的針尖將對細胞產生更大的局部影響。實驗中作用力設置為1 nN，對應于平均壓入深度為400 nm。

(a) CCCP處理前后活體PtK2細胞內線粒體的熒光圖像，0分鐘（頂部）和30分鐘（底部）（比例尺5 μm）；(b) 1 nN下的AFM測得形貌；(c) 實驗中的樣品下壓FD力曲線。頂部：均勻彈性材料；中部和底部：由于遇到硬細胞器而產生的兩個不連續的示例；(d) CCCP處理細胞在[50–100] nm壓入深度處的剛度圖（比例尺2 μm）（左）隨時間變化的線粒體區域（白色虛線）的對應剛度值（右）；(e) 對照組活體PtK2細胞內線粒體的熒光圖像（比例尺5 μm）（左），對照組細胞在[60–120] nm壓入深度處的剛度圖（比例尺2 μm）（中），隨時間變化線粒體區域（白色虛線）的對應剛度值（右）。

接下來作者使用控制藥物碳酰氯化苯基腙（CCCP）來干擾線粒體生理學，該藥物可以解偶線粒體氧化磷酸化并主要作為質子載體，降低ATP合酶的功能。同時使用光學顯微鏡和原子力顯微鏡（圖4a和b）能夠實時跟蹤藥物對線粒體伸長結構的破壞作用，*終導致線粒體碎裂。實驗開始時，大多數線粒體呈纖維狀。在暴露于藥物5分鐘后，已經能夠檢測到線粒體管狀網絡的紊亂（圖4a和b）。通過力曲線（圖4c）可以觀察到細胞內結構硬度的增加（圖4d）。結合光學顯微鏡，能夠確認這些結構與線粒體碎片有關。在對照組中，未經處理的細胞中沒有測量到這種劇烈的硬度變化（圖4e）。

在本文中，作者展示了觀察和感知細胞內膜組分的可能性。使用布魯克BioAFM型原子力顯微鏡（https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/microscopes/bioafm/jpk-nanowizard-v-bioscience.html）可以與各種光學顯微鏡相結合精確定位細胞內的細胞器和微生物并了解它們的機械性質。剛度斷層成像利用力曲線獲得的剛度的對比度，無需特定的樣品處理或染色即可定位細胞內的結構，它提供了到目前為止通過其他技術無法獲得的納米尺度上的機械信息。光學顯微鏡和透射電子顯微鏡為機械性能提供了寶貴且互補的信息。前者可以實時識別細胞組分，而后者允許對樣品進行超微結構分析。