——新型基于單分子級別熒光共振能量轉(zhuǎn)移(smFRET)的動態(tài)結(jié)構(gòu)生物學(xué)共聚焦顯微鏡系統(tǒng)

量化單分子和時間分辨熒光技術(shù)，為很多生命科學(xué)與材料科學(xué)領(lǐng)域提供了新的視野。迄今為止，因為其數(shù)據(jù)采集和分析需要具備較為專業(yè)的背景知識，使得該技術(shù)的普及非常緩慢。現(xiàn)在，PicoQuant可以提供一款全新的共聚焦顯微系統(tǒng)——單光子計數(shù)共聚焦顯微鏡系統(tǒng)Luminosa，它具備先進的軟硬件組合，在簡化日常操作流程的前提下，能有效的為操作者呈現(xiàn)高質(zhì)量的實驗數(shù)據(jù)。其配備的軟件為每種應(yīng)用技術(shù)都設(shè)定了標準化的引導(dǎo)操作流程。

本文將為您介紹單光子計數(shù)共聚焦顯微鏡Luminosa系統(tǒng)如何簡化單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(smFRET)的實驗過程。

單光子計數(shù)和計時應(yīng)用開啟了一個全新的實驗維度

共聚焦熒光顯微鏡在過去四十年中越來越受歡迎，因為其可視化動態(tài)過程和細胞結(jié)構(gòu)，使其成為一種用于分子、細胞和發(fā)育生物學(xué)的常規(guī)主力儀器。除了成像之外，點測量相關(guān)的實驗方法，例如熒光相關(guān)光譜(FCS)和單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(smFRET)也在生物物理學(xué)領(lǐng)域日漸普及。Z近發(fā)展起來引入時間分辨的實驗方法更是頗為引人注目。

對熒光基團熒光壽命的測量，揭示了新的信息維度，可以和光譜信息相互補充。每個熒光基團的熒光壽命信息是獨特的，因此可以作為多重檢測的識別特征。它同時也可以被單分子間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移所影響，例如，由于受體的存在導(dǎo)致供體壽命下降而反應(yīng)出的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率。

迄今為止，使用時間分辨熒光技術(shù)的門檻相對較高，需要專業(yè)的背景知識。而全新的單光子計數(shù)共聚焦顯微鏡系統(tǒng)Luminosa大大降低了使用門檻，并且將多種時間分辨工具集成統(tǒng)一。并為以下研究領(lǐng)域提供新的視野:
?單分子級別的動態(tài)結(jié)構(gòu)生物學(xué)
?相位分離引起的細胞機制
?環(huán)境監(jiān)測
?細胞膜的動態(tài)和結(jié)構(gòu)成像
?功能性的納米囊泡特性檢測
?研究單分子級別下的化學(xué)反應(yīng)
?先進材料的特性表征
?質(zhì)量和穩(wěn)定性檢測

在這些研究領(lǐng)域中，實驗復(fù)現(xiàn)是一個難題。可能的原因之一在于所使用的顯微方法的細節(jié)描述不充分。為了提升準確性，可重復(fù)性以及實驗質(zhì)量，通過顯微系統(tǒng)的自動化來減少人為誤差是一個潛在的可行方案，例如，硬件部件的自動化，以及將傳感單元集成到智能軟件中。這也增加了成像系統(tǒng)的易用性，總而言之，為研究人員節(jié)省了寶貴的時間和材料。此外，自動化提高了通量，甚至開辟了新的實驗可能性，如延時成像、多位置成像或多點時間軌跡。

直觀的工作流程，易于使用

單光子計數(shù)共聚焦顯微鏡系統(tǒng)Luminosa在壽命測量領(lǐng)域有著Z佳的性能表現(xiàn)。該顯微系統(tǒng)同樣對于單分子靈敏度進行了優(yōu)化，可以進行單分子級別的各種實驗。我們通過MicroTime200系統(tǒng)的實驗經(jīng)驗設(shè)計了這個全新的顯微鏡系統(tǒng)，并為它挑選了一批Z佳硬件組合。通過精簡和優(yōu)選后的光學(xué)元件使得該系統(tǒng)達到了極高的靈敏度水平。

用戶既可以選擇使用高速的振鏡系統(tǒng)進行掃描成像，也可以一鍵切換為壓電平移臺的物鏡掃描模式。這種切換功能目前在其他顯微系統(tǒng)中是沒有的。壓電掃描成像避免了振鏡掃描模式下的信號損失，根據(jù)波長的不同，大約可以提升20-30%左右的光子信號。用戶同時也可以選擇時間響應(yīng)更優(yōu)秀的混合式光電倍增管探測器，或者高探測靈敏度的單光子雪崩二極管作為定制配置。

超簡單的界面操作流程

單光子計數(shù)共聚焦顯微鏡系統(tǒng)Luminosa軟件是從頭開始創(chuàng)建的。它的設(shè)計使其工作流程簡單快捷，使用戶能夠更加專注于樣品特性本身。良好的交互界面布局，清晰排列的界面僅顯示與每個應(yīng)用相關(guān)的參數(shù)，保證了測量數(shù)據(jù)的重復(fù)精度。單光子計數(shù)共聚焦顯微鏡系統(tǒng)Luminosa軟件包括smFRET功能，F(xiàn)CS熒光相關(guān)光譜，以及時間分辨成像功能，同時也具備有自定義測量和分析模式。

系統(tǒng)只需單擊一個按鈕，在不到一分鐘的時間內(nèi)，便可完成無樣品自動對準。對準非常準確，無需進一步優(yōu)化即可直接進行FCS熒光相關(guān)光譜測量，所以通過簡單的操作就可以確保系統(tǒng)始終處于相同的Z佳狀態(tài)。

開始操作時，用戶選擇在下一個實驗中使用哪種測量技術(shù)方法。軟件中清晰排列的軟件界面僅顯示該類型測量所需的參數(shù)，從而將意外錯誤的風(fēng)險降至Z低。根據(jù)選擇樣品中存在的熒光團，硬件會自動正確配置。然后根據(jù)實驗環(huán)境分配分析通道。大多數(shù)商用LSM共聚焦顯微系統(tǒng)中已經(jīng)提供了類似的功能，但是現(xiàn)在還設(shè)置了對時間分辨測量很重要的其他參數(shù)（例如激光的重復(fù)頻率），從而減少對用戶所需專業(yè)知識的要求。設(shè)置的保存和加載，保證了測量的可重復(fù)性。此外，適當(dāng)?shù)脑紨?shù)據(jù)與實際數(shù)據(jù)一起保存，方便以后查詢使用。

圖2. 使用532nm和640 nm脈沖交錯激發(fā)和雙通道檢測的smFRET實驗的硬件和分析設(shè)置屏幕截圖，產(chǎn)生三個邏輯分析通道。

激發(fā)光的功率校準模塊同時可以提供設(shè)置和顯示激發(fā)功率(單位μw，如圖2)的功能，并且不需要額外的功率測量設(shè)備。自動調(diào)節(jié)耗時不到十秒，而且可以在不移動樣品的情況下連續(xù)進行。參考文獻[2]表明了激發(fā)光強的精確控制在可重復(fù)精度中的重要性，例如它會影響到光漂白，光毒性等等，從而在結(jié)果中引入不確定性。 這個問題對實驗的影響非常大， QUAREP - LiMi (光顯微鏡質(zhì)量和重復(fù)精度評估組織)也將激發(fā)光功率的控制放在工作的首位。

在實驗進行測量時，會實時顯示多個在線預(yù)覽。這樣用戶就可以把控樣品的情況，從而進一步進行正確的采集參數(shù)設(shè)定。在線實時分析實際上是一種動態(tài)幫助信息，旨在提高采集到的數(shù)據(jù)質(zhì)量。

新軟件結(jié)合了用于熒光壽命成像(FLIM)，熒光相關(guān)光譜(FCS)和單分子檢測的GPU加速算法。 強大的算力使得其可以實現(xiàn)自動分析程序，并將有關(guān)實驗類型、硬件配置、熒光團和數(shù)據(jù)維度的信息考慮在內(nèi)，因此無需用戶交互即可獲得初始結(jié)果。盡管如此，原始數(shù)據(jù)保持不變，以便于以后可以使用不同的參數(shù)設(shè)置重新分析。

基于動態(tài)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(smFRET)

圖3. 典型的smFRET應(yīng)用 - 研究蛋白和DNA的作用(圖片來自biorender.com)

單分子研究，以及更具體的smFRET方法學(xué)，已成為研究蛋白質(zhì)和核酸動態(tài)結(jié)構(gòu)變化的標準工具。這些實驗方法可以揭示在納秒到秒級別的時間維度上的動態(tài)活動過程。例如成鏈動力學(xué)，蛋白的結(jié)合，折疊，探測變構(gòu)信號，寡聚化以及聚集現(xiàn)象，如圖3所示。實驗結(jié)果對其他實驗方法，例如電鏡，核磁共振等，進行了有效的補充。這樣完整的數(shù)據(jù)就可以被歸檔到到綜合結(jié)構(gòu)模型的存檔系統(tǒng)PDB-Dev [3]。近年來，內(nèi)在無序蛋白質(zhì)的生物學(xué)相關(guān)性研究越來越多，突出了這些方法的力量。

smFRET測試既可以在分子自由移動的溶液中進行，也可以對分子固定在蓋玻片表面上的樣品實施探測。單光子計數(shù)共聚焦顯微鏡系統(tǒng)Luminosa為兩種樣品分別提供了專門的工作流程。

選擇正確的FRET對信息后，硬件會自動切換到對應(yīng)的配置，即設(shè)置激發(fā)波長和功率，啟用供體和受體的脈沖交錯激發(fā)，并選擇正確的檢測器和發(fā)射濾光片，如圖2所示。此外，系統(tǒng)會根據(jù)實驗條件選擇分析通道：供體激發(fā)后的供體發(fā)射，供體激發(fā)后的敏化受體發(fā)射和直接受體激發(fā)后的受體發(fā)射作為對照。可以選擇不同的停止條件進行采集。例如，在分子溶液樣品測試時，停止條件可以是爆發(fā)發(fā)射數(shù)量、總時間、爆發(fā)頻率的減少量等等。這有助于收集具有充分統(tǒng)計數(shù)據(jù)的一致數(shù)據(jù)集。

采集數(shù)據(jù)時會顯示四種在線數(shù)據(jù)預(yù)覽: FRET效率（E）與化學(xué)計量（S）的直方圖、爆發(fā)直方圖、強度時間軌跡和TCSPC直方圖，以及用于供體和受體壽命衰減的在線擬合。E和S在線計算并顯示在E/S直方圖中。根據(jù)[4]中的數(shù)據(jù)處理標準步驟，這些在線數(shù)據(jù)通過四種因子進行校正。這些校正因子分別是：光譜串?dāng)_因子α，激發(fā)波動因子β，探測效率因子γ以及直接激發(fā)因子δ。校正后以及未校正數(shù)據(jù)都在圖4中有所顯示，這樣就可以評估校正步驟帶來的影響，這些因子在隨后都可以手動進行修改。

圖4. E/S直方圖將單個FRET爆發(fā)的值顯示為單個點，綠色為校正后的曲線，紅色為未校正曲線。

分子穿過固定的激光聚焦光斑時，所發(fā)出的熒光信號被采集。這些信號可以連同共聚焦針孔大小來確定聚焦光斑的體積。觀察時間窗口，例如，爆發(fā)持續(xù)時間是由聚焦體積來決定的。在衍射極限級別的聚焦體積下，極短時間內(nèi)就有高量級的光子產(chǎn)出，可以被用于監(jiān)控快速的分子動態(tài)過程。增大聚焦體積的同時會延長爆發(fā)持續(xù)時間，如圖5所示。這樣就可以觀察慢速分子的動態(tài)過程和測量大分子較緩慢的擴散特性。總體上說，如[5]中表述的，“更大的聚焦體積，結(jié)合高功率的激發(fā)，每個爆發(fā)持續(xù)時間能產(chǎn)出Z高的光子量級”。單光子計數(shù)共聚焦顯微鏡系統(tǒng)Luminosa能夠根據(jù)激發(fā)波長的不同，將觀察體積從衍射極限的3倍增加到6倍。在軟件中點擊一個按鈕，可以減小激發(fā)光束直徑，對物鏡進行下充，相應(yīng)調(diào)整光路和共焦探測針孔的大小，從而增加有效觀測體積。

圖5. 爆發(fā)持續(xù)時間對比圖，紅色為較大聚焦體積下，藍色為較小聚焦體積下。

在研究分子固定在表面的樣品時，用戶既可以選擇壓電掃描臺來獲得更多的光信號，也可以選擇振鏡掃描方式來快速成像。樣品自動保持對焦，而平鋪和拼接可實現(xiàn)大面積成像，如圖6所示。

圖6. 用Cy3B和Atto647N標記的單DNA折紙固定在表面上。九張成像圖片拼接成了一張21x21μm的圖像。右圖：單張小圖的FLIM分析結(jié)果。上圖：平均壽命圖。下圖：多指數(shù)壽命擬合結(jié)果疊加圖。樣品數(shù)據(jù)由弗里堡大學(xué)，物理學(xué)院提供。

采集到一個成像圖塊后，通過自動算法在特定標準下，測算出單分子的位置。隨后對這些單分子進行逐個探測，并在停止條件達到之前記錄其光強隨時間變化的數(shù)據(jù)。然后，下一個圖塊區(qū)域?qū)⒈粧呙韬统上瘢源祟愅啤Ｍㄟ^這種方式，可以輕松獲得具有足夠統(tǒng)計數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)集。

討論和展望

單光子計數(shù)共聚焦顯微鏡系統(tǒng)Luminosa的自動化工作流程提高了系統(tǒng)的易用性并減少了人為錯誤，從而節(jié)省了研究人員的寶貴時間和樣品材料。重要的是，自動設(shè)置的參數(shù)值可以保存為元數(shù)據(jù)，而在手動系統(tǒng)中，必須手動記錄這些值。綜上所述，與手動操作的系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)提高了實驗的精確度、可重復(fù)性和實驗質(zhì)量。但是，審查配置和設(shè)置（例如染料數(shù)據(jù)庫條目或丟棄事件的閾值）以確保它們適合新實驗仍然是很重要的。

許多專業(yè)的知識應(yīng)用于制定系統(tǒng)的工作流程和參數(shù)設(shè)定中，所以實際使用人員并不需要具備相關(guān)專業(yè)知識。即便如此，在樣品制備和數(shù)據(jù)闡釋方面，用戶仍然需要一定的知識儲備。

PicoQuant持續(xù)研發(fā)新的熒光顯微鏡科研工具，例如光譜分辨FLIM系統(tǒng)，結(jié)合了壽命和光譜信息，可同時并行多目標成像，詳情參閱文章[6]和[7]。PicoQuant同時活躍于各種與學(xué)術(shù)界合作的研究項目中，來拓展新型顯微系統(tǒng)的概念和實驗方法。例如，NG-FLIM計劃，旨在實現(xiàn)一種高空間分辨率和高時間分辨率的顯微系統(tǒng)，這樣可以更加簡便和精確的在活體細胞和組織中快速觀察膜受體的情況。不同的光學(xué)方法再結(jié)合起來以提高成像的對比度，基于深度學(xué)習(xí)的數(shù)據(jù)處理方式用于自動化的數(shù)據(jù)評估。這項計劃的參與者包括PicoQuant、Nanotag Biotechnologies、Arivis、哥廷根大學(xué)以及哥廷根中心醫(yī)藥大學(xué)。該計劃由德國聯(lián)邦教育和研究部的”Photonics Research in Germany”項目(項目編號 13N15324)撥款。另一個例子就是糾纏態(tài)的雙光子吸收，可以被應(yīng)用于化學(xué)選擇性熒光顯微鏡。PicoQuant正與弗勞恩霍夫應(yīng)用光學(xué)和精密工程研究所、M Squared Lasers以及耶拿大學(xué)一起合作研究此主題。該方向同樣由德國聯(lián)邦教育和研究部支持，隸屬于LIVE2QMIC(13N15953)研究項目。

結(jié)論

PicoQuant的新型單光子計數(shù)共聚焦顯微鏡系統(tǒng)Luminosa可以幫助研究者輕松的將單分子時間分辨熒光顯微實驗方法廣泛應(yīng)用于生命和材料科學(xué)研究領(lǐng)域，而不需要操作者本身具備豐富的經(jīng)驗。得益于新的軟件功能與先進的硬件相結(jié)合，并且更好地集成了硬件和軟件，該系統(tǒng)以可重復(fù)的方式快速提供高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。這使研究人員能夠自信地采用smFRET等新方法，從新的角度觀察樣品。
[1] M.Baker: 1,500 scientists lift the lid on re-producibility，Nature 533 (2016) 452–454。
[2] P.Montero Llopis et al.: Best practices and tools for reporting reproducible fluores-cence microscopy methods，Nat Methods 18 (2021)1463–1476。
[3] E.Lerner，A. Barth，J.Hendrix et al.: FRET-based dynamic structural biology: Challenges， perspectives and an appeal for open-science practices.Ashok.(2021) eLife 10:e60416。
[4] B.Hellenkamp，S.Schmid，O.Doros-henko et al.: Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements – a multi-laboratory benchmark study，Nat Methods 15 (2018) 669–676。
[5] G.Agam，C.Gebhardt，M.Popara et al.: Re-liability and accuracy of single-molecule FRET studies for characterization of struc-tural dynamics and distances in proteins.(2022)bioRxiv 2022.08.03.502619。
[6] T.Nieh?rster et al.: Multi-target spectrally resolved fluorescence lifetime imaging mi-croscopy，Nat Methods 13 (2016) 257–262。
[7] S.Rohilla et al.: Multi-target immuno-fluorescence by separation of antibody cross-labelling via spectral-FLIM-FRET，Sci Rep 10 (2020) 3820。

德國PicoQuant

PicoQuant由四位年輕的科學(xué)家和工程師于1996年成立，致力于發(fā)展真正為科學(xué)家所使用的光學(xué)儀器。該公司注重于在眾多科學(xué)領(lǐng)域為各國科研工作者提供創(chuàng)新型和高質(zhì)量的產(chǎn)品。 PicoQuant不忘初衷，砥礪前行，現(xiàn)已成為時間分辨光學(xué)測量領(lǐng)域的領(lǐng)航者。

關(guān)于作者

Maria Loidolt-Krüger曾就讀于凱澤斯勞滕大學(xué)生物物理系，并在哥廷根普朗克研究所的Stefan Hell小組獲得碩士和博士學(xué)位，專業(yè)方向圍繞STED顯微系統(tǒng)的進一步開發(fā)。2018年畢業(yè)后即加入PicoQuant公司，成為顯微應(yīng)用專家。2022年作為PicoQuant公司科學(xué)內(nèi)容創(chuàng)作者。同時也在柏林應(yīng)用科技大學(xué)兼職講師，主要方向為光顯微學(xué)。

武漢東隆科技有限公司是德國PicoQuant公司國內(nèi)總代理，如需了解以上產(chǎn)品更多詳情，請隨時聯(lián)系我們！